目的：探讨纤溶酶注射液(FI)对链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病肾病(DN)的治疗作用及机制。方法：40只SD大鼠,随机分成正常对照组(NC组,10只)和研究组(30只)。研究组采用STZ注射诱导大鼠模型成功20只,随机分为DN组和DN+FI组,各10只。DN+FI组大鼠用FI每日尾静脉注射,对DN组大鼠进行连续8周治疗。每日观察各组大鼠的一般状况,计算肾脏脏器系数,光镜检查肾组织形态改变,生化法检测尿蛋白(UP)量、血清超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,蛋白质印迹法检测肾皮质组织中纤溶酶原活化抑制因子-1(PAI-1)蛋白的表达量。结果：经FI治疗后,DN组大鼠的一般状况逐渐接近正常,肾脏脏器系数降低,UP量减少,肾组织病理变化明显改善,与NC组比较,DN组大鼠血清的SOD、CAT活性明显降低,UP含量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。而与DN组大鼠比较,DN+FI组大鼠的SOD、CAT活性显著提高,UP含量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论：FI对STZ诱导的DN大鼠肾脏具有明显的保护作用,其机制可能与其提高机体抗氧化能力、降低肾组织PAI-1蛋白表达有关。
1资料与方法1.1实验动物
选取清洁级雄性SD大鼠40只,8周龄,体重~g,购自临沂市实验动物中心。动物单笼饲养,自由摄食、饮水,饲养室温度保持在(22±2)℃,自然光照,适应3d后用于实验。随机分成正常对照组(NC组,10只)和研究组(30只)。
1.2试剂
链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、SOD、CAT检测试剂盒均购自Sigma公司(St.Louis,MO,USA);尿蛋白(urineprotein,UP)考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司;FI购自北京赛升药业股份有限公司;PAI-1小鼠单克隆抗体(C-9)、兔抗鼠IgG-HRP单克隆抗体均购自SantaCruz公司(SantaCruz,CA,USA)。
1.3试验方法
研究组大鼠禁食12h后一次性腹腔注射STZ50mg/kg(溶于0.1mol/L,pH=4.2的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液中,终浓度为1%,现配现用),注射72h后连续3d大鼠尾静脉采血检测血糖。以连续3次血糖浓度16.7mmol/L,尿量原尿量%,UP排泄30mg/24h尿者为成模标准。最终,建模成功的大鼠20只,成功率67%。NC组大鼠给予等量缓冲液注射。研究组大鼠随机分为DN组和DN+FI组,各10只。
1.4动物给药及样品收集
DN+FI组大鼠采用尾静脉注射2U/kg的FI(溶于生理盐水,1U/ml),连续给药8周,NC组和DN组给予等量的生理盐水。各组实验大鼠于8周后处死,处死前1d代谢笼收集24h尿液,记录尿量,麻醉后,称重、颈动脉取血,分离血清。尿液、血清置于-80℃冰箱保存,用于检测生化指标。同时分离肾脏,用滤纸吸干后称重,一侧肾脏置-80℃冰箱保存供Westernblotting检测用,部分肾脏以10%中性甲醛固定,用于组织病理学检查。
1.5组织病理学检查
经甲醛溶液固定的肾脏组织,常规酒精脱水、透明、石蜡包埋后,连续4μm切片,苏木素伊红染色(HE)后,在光镜下观察肾脏的组织形态学变化。
1.6生化指标测定
检测UP、血清SOD、CAT的含量,均按试剂盒的说明书操作。血糖浓度用强生血糖仪测定。
1.7蛋白质印迹法
肾皮质组织经充分匀浆,离心后取上清作为蛋白提取物。等量的蛋白(50μg)在加入上样缓冲液充分混匀后,沸水浴煮5min,瞬时离心后进行SDS-PAGE。电泳后的蛋白用恒流湿法转移到硝酸纤维素膜上。蛋白膜经封阻、洗涤后与PAI-1一抗在4℃孵育杂交过夜。洗膜后加入IgG-HRP二抗,在室温下孵育杂交2h。蛋白膜洗涤后,在膜的蛋白面滴加等比例混合ECL检测液A和B,用Bio-RadChemiDocXRS(Hercules,CA,USA)曝光,截获图像。
1.8统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用χ^2检验。P0.05表示差异具有统计学意义。
2结果2.1一般状况
DN组注射STZ诱导DM后,进食量在病变初期增加,病变后期食量减少、尿频且量多、体重减轻、生长缓慢、毛发枯槁发黄等状况。而NC组大鼠食量、饮水、尿量及精神状态基本正常。经FI治疗后,DN+FI组大鼠的饮水、食量、尿量、体重、毛发均逐渐接近正常。
2.2脏器系数
与NC组大鼠比较,DN组大鼠其脏器系数显著增加,经DN+FI组大鼠脏器系数明显降低。
2.3肾组织病理变化
病理组织学检查显示,DN组大鼠肾小球充血水肿明显,体积增大,肾小管上皮细胞变性坏死脱落,基底膜破坏,部分结构不清。DN+FI组大鼠肾组织结构明显改善,只表现为轻微的充血,管腔分开,基底膜完整,结构清晰,肾小球和肾小管结构接近正常。见图1。
2.4血清中SOD、CAT、UP情况
与NC组比较,DN组大鼠血清的SOD、CAT活性明显降低,UP含量明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。而与DN组大鼠比较,DN+FI组大鼠的SOD、CAT活性显著提高,UP含量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。见表1。
2.5肾皮质组织中PAI-1蛋白表达
各实验组大鼠肾皮质组织中均可检测到PAI-1蛋白的表达。DN组大鼠肾皮质组织中PAI-1的表达量明显高于NC组大鼠。相对于DN组大鼠,DN+FI组其肾皮质组织中PAI-1的表达量显著降低。见图2。
3讨论DN是DM常见而严重的微血管并发症,与血栓形成密切相关,改善微循环是治疗DN的一个重要方面。临床上已经证实FI可以改善纤溶系统的功能,在治疗动脉硬化性脑病、脑梗死、下肢深静脉血栓等疾病时获得了较好的效果。然而,FI用于早期干预治疗DN却未见报导。在本研究中,通过建立DN大鼠模型来初步探讨FI对DN的治疗作用及其可能的机制。
采用FI对DN大鼠模型进行8周的治疗后发现,DN大鼠的主要症状和肾脏病理改变均得到很大的改善。经过治疗后,DN大鼠的饮水、食量、尿量、体重、毛发均逐渐接近正常,脏器系数明显降低。病理组织学检查显示,治疗后DN大鼠肾组织结构明显改善,只表现为轻微的充血,管腔分开,基底膜完整,结构清晰,肾小球和肾小管结构接近正常。这说明FI对DN大鼠的干预治疗是有效的。以往的临床实验已经证实,FI治疗血栓性心血管疾病效果明显,且不降解凝血因子、补体、血浆蛋白等,出血并发症少,安全性高[7]。但FI是否真正能够应用于临床上治疗DN还需要严格的临床实验来证实。
近年来越来越多的证据表明氧化应激是各种途径导致DN病变的共同机制。在本研究中,用FI对DN大鼠模型进行治疗后,其血清中抗氧化酶SOD、CAT活性显著提高。这提示DN大鼠体内的氧化应激状态得到明显的改善,FI可能通过提高DN大鼠体内的抗氧化能力的机制来保护肾脏。PAI-1主要由血管内皮细胞合成,可抑制纤溶酶原的活化,降低肾小球和肾小管间质细胞外基质的降解,促进组织细胞外基质的积聚,加速DN的发生[8-10]。本研究结果显示,DN大鼠在经FI治疗后,其肾皮质组织中PAI-1的表达量显著降低。这提示FI对DN大鼠的治疗作用可能是通过抑制PAI-1的表达,促进纤溶酶原的活化,从而加快肾小球和肾小管间质细胞外基质的降解的机制来实现。
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（论文来源：中国实用医药7年7月第12卷第20期-）
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