摘要：目的研究补骨脂酚对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用及其机制。方法采用噻唑蓝法（MTT法）考察补骨脂酚对MCF-7细胞生长的影响；采用流式细胞术检测补骨脂酚处理后细胞周期分布情况及活性氧（ROS）的产生；利用荧光显微镜观察补骨脂酚对MCF-7细胞核的影响；采用蛋白免疫印迹法检测补骨脂酚作用下MCF-7细胞凋亡、周期相关蛋白和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族蛋白的表达；引入ROS清除剂及MAPK家族蛋白抑制剂考察其在补骨脂酚作用下对MCF-7细胞生长抑制率和细胞周期相关蛋白表达的影响。结果补骨脂酚可以呈时间、剂量依赖性抑制MCF-7细胞生长，其抑制作用明显强于阳性药5-氟尿嘧啶。补骨脂酚可诱导MCF-7细胞产生ROS，同时上调p-p53及p21蛋白表达水平，下调细胞周期相关蛋白CDK2和CyclinA2表达水平，进而引起细胞发生S期阻滞。而上述影响可被ROS清除剂Tiron逆转，表明ROS参与补骨脂酚诱导的S期阻滞。加入p38MAPK抑制剂SB后，细胞产生的ROS水平降低，表明ROS的产生依赖于p38MAPK途径。结论补骨脂酚抑制MCF-7细胞增殖的作用与其引起细胞发生S期阻滞有关，ROS参与S期阻滞过程。
乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，是全球女性癌症死亡的主要原因之一，其发病率占所有癌症病例的23%，死亡率达14%[1]。近年来我国乳腺癌发病率及死亡率呈明显上升趋势，在女性生殖系统恶性肿瘤死因中，乳腺癌已从第2位升至第1位[2]。
恶性肿瘤的发生发展变化十分复杂，但正气虚弱是恶性肿瘤发生发展的主要病因病机已被广泛认可。《诸病源候论》记载：“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于脏腑之气所为也”。《医宗必读》云：“积之成也，正气不足而后邪气踞之”。《外证汇编》云：“正气虚则成岩”。可见，正气虚弱是肿瘤发生的根本原因之一[3]，故扶正固本是恶性肿瘤的基本治则，扶正类中药常被用来改善患者体质，达到“扶正即祛邪”的效果，起到抗肿瘤作用[4]。
补骨脂PsoraleacorylifoliaLinn.作为传统中药，最早记载于《开宝本草》，属扶正类中药，具有温肾助阳、固精缩尿、温脾止泻、纳气平喘之功效，临床应用广泛。现代研究证实，补骨脂具有抗肿瘤、抗菌、抗疟疾、抗抑郁及增强免疫力等多种活性[5]。补骨脂酚（bakuchiol，BAK）是从补骨脂种子中分离得到的一种异戊二烯酚萜类化合物。据报道，BAK在体内、外对于肺癌、前列腺癌、口腔癌等肿瘤细胞均具有明显的生长抑制作用[6-8]。陈红莉等[9]研究发现BAK可以明显抑制人乳腺癌T-47D及MDA-MB-细胞增殖，但机制不明确。目前对于BAK抗乳腺癌的作用机制研究较少。本研究通过考察BAK对于人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，初步揭示BAK在体外抗乳腺癌作用相关机制，为其进一步的临床应用提供理论依据。
1材料
1.1细胞
MCF-7细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.2药品与试剂
BAK由天津中医药大学高秀梅教授惠赠，经HPLC测定质量分数＞99.5%。BAK无菌条件下溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，?20℃冻存。药品使用时，用DMEM培养液稀释至所需浓度（DMSO≤0.05%）。
DMEM培养基（美国Gibco公司）；TBD胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；噻唑蓝（MTT）、吖啶橙（AO）、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针、PD、SB、SP、4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸二钠盐（Tiron，美国Sigma公司）；Caspase-3、p53、p-p53（Ser15）、cdc2、细胞周期蛋白D1（CylcinD1）、CyclinB1、CyclinA2、周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、CDK4、JNK、p-JNK1/2/3（Thr/Thr）、p38、p-p38MAPK（Thr/Tyr）、β-actin抗体（美国SantaCruz公司）；二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，批号-，质量分数≥99.6%），中国食品药品检定研究院。
1.3仪器
CO2恒温培养箱（上海Thermo公司）；超净工作台（苏州苏净集团安泰公司）；超纯水仪（四川成都优普公司）；倒置显微镜（Motic公司）；荧光显微镜（日本Olympus公司）；电泳槽（北京六一仪器厂）；转移槽、垂直电泳槽（北京百晶生物技术有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；高速冷冻离心机（上海HealForce公司）；摇床（金坛市新航仪器厂）。
2方法
2.1细胞培养
将MCF-7细胞接种在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中（含U/mL青霉素、mg/mL链霉素），于37℃、5%CO2培养箱中培养。待贴壁细胞生长成致密单层时，进行传代培养。
2.2MTT实验
取处于对数生长期的MCF-7细胞，以1×个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔μL。于37℃、5%CO2条件下培养24h，分别加入BAK或5-FU10.7、16.0、24.0、36.0、54.0μmol/L，或分别提前1h加入不同的抑制剂，培养12、24、36、48h后，弃去孔内培养液，每孔加入μL5mg/mLMTT，继续孵育2.5～3.0h，弃去孔内液体，每孔加入μLDMSO，酶标仪nm处测定吸光度（A）值，并计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率＝(A对照－A实验)/A对照
2.3AO染色检测细胞凋亡
将MCF-7细胞以2.5×个/孔接种于6孔板中，培养24h后，加入30μmol/LBAK，继续培养48h后，细胞用10μg/mLAO染色30min，荧光显微镜下观察细胞核的形态。
2.4流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期的MCF-7细胞接种于25mL培养瓶中，密度为5×个/mL。培养24h后，加入终浓度为30μmol/L的BAK或提前1h加入μmol/LTiron，分别作用12、24、36、48h。将药物处理后的细胞用PBS洗1次，胰酶消化后，合并PBS和消化液于离心管中，离心弃尽上清，加入μLPBS混悬细胞，预冷的70%乙醇?20℃固定过夜，r/min离心10min，弃尽上清，每份样品加入含RNase的50μL碘化丙啶（PI，1mg/mL），避光、冰浴30min后，用流式细胞仪检测，每个样品计数1×个细胞。
2.5流式细胞仪检测活性氧（ROS）水平
取对数生长期的MCF-7细胞，将细胞密度调整至3×个/mL，接种于6孔板中，培养24h后，加入终浓度为30μmol/L的BAK分别作用12、24、36、48h，或提前1h加入Tiron、SP和SB作用48h。将药物处理后的细胞用PBS洗1次，每孔加入1mL用DMEM稀释的10μmol/LDCFH-DA，37℃避光孵育45min，收集细胞，用PBS洗，胰酶消化，合并PBS与消化液于离心管，离心弃尽上清后，每个样品加入μLPBS重悬细胞，用流式细胞仪检测，每个样品计数1×个细胞。
2.6Westernblotting法检测蛋白表达
取对数生长期的MCF-7细胞接种于75mL培养瓶中，培养24h后，换成新鲜的DMEM培养液，同时加入30μmol/L的BAK或提前1h加入Tiron，继续培养12、24、36、48h。收集细胞，冰浴裂解，离心后取上清，得细胞总蛋白，加入5×上样缓冲液，混匀后沸水浴使蛋白变性。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，上样，SDS-PAGE电泳后，V恒压湿转2～3h，用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2h，加入一抗β-actin（1∶）、Caspase-3（1∶）、p53（1∶）、p-p53（1∶）、p21（1∶）、CyclinA2（1∶）、CyclinB1（1∶）、CyclinD1（1∶）、CDK2（1∶）、CDK4（1∶）、cdc2（1∶）、JNK（1∶）、p-JNK（1∶）、p38（1∶）、p-p38MAPK（1∶），4℃孵育过夜。PBS洗3次，每次10min，用Tris-NaCl洗1次，10min，根据一抗的来源选择合适的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶0），室温孵育2.5h。Tris-NaCl洗3次，每次10min。ECL化学发光显色，X射线胶片曝光。
2.7统计学方法
所有数据以表示，采用SPSS17.0进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1BAK对MCF-7细胞增殖的影响
结果如图1所示，BAK对MCF-7细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性，48h的半数抑制浓度（IC50）值为30μmol/L。与5-FU相比，BAK对MCF-7细胞具有更明显的增殖抑制作用。
3.2BAK对MCF-7细胞凋亡的影响
为了证实BAK是否以诱导细胞凋亡的方式引起MCF-7细胞的增殖抑制，采用AO荧光染色观察细胞核的形态变化。如图2所示，未经过BAK处理的细胞核染色均匀，细胞壁完整。BAK处理后，细胞核并没有发生凋亡应有的形态学特征，如染色致密、形成凋亡小体等。
3.3BAK对MCF-7细胞周期的影响
釆用PI荧光染色结合流式细胞术，分析BAK对MCF-7细胞周期的影响。如图3所示，对照组S期细胞比例为9.28%，30μmol/LBAK作用12、24、36、48h后S期细胞比例分别升高至10.84%、18.30%、19.30%、28.00%。当μmol/LROS清除剂Tiron预处理1h，BAK作用48h后，S期细胞比例则降为9.59%。以上结果表明，BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制主要表现为S期阻滞，且ROS在此过程中发挥促进作用。
3.4BAK对MCF-7细胞ROS产生的影响
为了研究BAK是否能诱导MCF-7细胞产生ROS，利用DCFH-DA荧光染色法测定细胞内ROS的生成量。如图4-A所示，BAK作用细胞0、12、24、36、48h后，其ROS的生成量分别为3.36%、46.20%、49.73%、56.67%、66.67%。特别是BAK作用细胞12h时，ROS的生成量明显升高，且随着作用时间的延长逐渐增加。而ROS清除剂Tiron预处理1h后，ROS的生成量降低至33.55%，与BAK48h组比较显著降低（P＜0.01）。以上结果表明BAK可时间依赖性地诱导MCF-7细胞产生ROS。为了确定ROS在BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制中的作用，引入了ROS的清除剂Tiron考察BAK对细胞增殖的影响。结果显示（图4-B），单独加入30μmol/LBAK处理MCF-7细胞48h后，细胞增殖抑制率为58.95%，而提前加入μmol/LTiron作用1h，再加入30μmol/LBAK共孵育48h，增殖抑制率则降为35.62%（P＜0.01）。综合上述实验结果表明ROS在BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制中发挥促进作用。3.5BAK对MCF-7细胞MAPKs通路相关蛋白表达的影响
为了探究BAK是否通过MAPKs通路发挥其对MCF-7细胞生长抑制作用，采用MTT法考察MAPKs通路抑制剂对BAK引起的MCF-7细胞生长抑制作用的影响。结果如图5所示，单独加入BAK时，细胞生长抑制率为69.83%，而分别加入JNK抑制剂SP0.25μmol/L、p38抑制剂SB0.5μmol/L和ERK抑制剂PD2μmol/L共同作用细胞48h后，细胞生长抑制率分别为50.66%、55.55%、67.95%。表明SP和SB可以显著逆转BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制，而PD无影响，提示JNK和p38参与BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制过程。
同时，采用Westernblotting法检测了p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白表达情况。结果如图6所示，随着BAK作用时间的增加，p38、JNK蛋白表达水平没有明显变化，活性形式的p-JNK和p-p38的表达水平逐渐升高，且具有显著的时间依赖性，而加入ROS清除剂Tiron后，p-JNK和p-p38蛋白表达水平并没有下降。表明BAK通过JNK及p38途径发挥MCF-7细胞增殖抑制作用，但ROS不参与BAK对JNK和p38的活化。3.6BAK通过p38MAPK通路对MCF-7细胞ROS产生的影响
为了研究p38MAPK通路与BAK诱导的MCF-7细胞ROS产生之间的关系，30μmol/LBAK作用于MCF-7细胞48h，或提前加入0.25μmol/LSP、0.5μmol/LSB作用1h后，再加入30μmol/LBAK共孵育48h，采用DCFH-DA荧光染色法检测细胞内ROS的生成量。如图7所示，单加BAK时，ROS的生成量为44.93%，而提前1h加入SB时，ROS生成量降为35.97%，差异显著（P＜0.05）。而与SP共孵育时，ROS生成量没有明显变化，说明BAK通过p38MAPK途径而非JNK途径诱导MCF-7细胞产生ROS。
3.7BAK通过诱导ROS产生对MCF-7细胞周期蛋白表达的影响
如图8所示，随着BAK作用时间的延长，p-p53及p21蛋白表达水平上升（P＜0.05、0.01），且呈时间依赖性，而加入ROS清除剂Tiron后表达水平降低（P＜0.01）。结果表明，BAK诱导细胞产生ROS，进而上调p53蛋白表达量并使其活化，激活其下游靶蛋白p21，使其表达水平升高。
进一步检测S期主要调节蛋白CyclinA2和CDK2的表达量及G0/G1和G2/M期相关蛋白表达水平。结果如图8所示，随着BAK作用时间的增加，CyclinA2和CDK2表达水平降低（P＜0.05、0.01），且呈时间依赖性，而加入ROS清除剂Tiron后，CyclinA2和CDK2蛋白表达水平升高（P＜0.05、0.01）。而G0/G1期和G2/M期相关蛋白表达量均没有明显变化。结果表明，BAK可通过诱导ROS的产生下调S期相关调节蛋白CyclinA2和CDK2表达水平。
4讨论
乳腺癌是一种女性最常见的恶性肿瘤[10]。近年来，中药来源的活性化合物已逐渐成为新型抗乳腺癌药物的重要来源。本研究发现中药补骨脂主要成分BAK呈时间、剂量依赖性地抑制MCF-7细胞增殖，且其抑制作用明显强于临床常用抗肿瘤药物5-FU。进一步研究发现，BAK并未引起MCF-7细胞发生细胞核固缩或碎裂等凋亡现象，且BAK处理后G1期细胞比例较低，说明BAK不能诱导MCF-7细胞发生凋亡。然而，BAK可以呈时间依赖性地上调S期细胞比例，提示BAK通过诱导MCF-7细胞发生S期阻滞，进而抑制细胞增殖。
细胞周期阻滞是一种有利于机体的保护机制，当细胞受到外界环境刺激发生DNA损伤时，可通过几个细胞周期监测点的调节来启动细胞周期延迟或阻滞，以便于DNA修复。细胞周期主要分为G0/G1、S和G2/M期，在细胞受到生长因子或其他因子刺激时，细胞从G0期（静止期）退出，进入G1期（活跃期），然后再进入S期，在S期时，DNA的合成发生。S期阻滞在大多数癌症发病机制中起了重要的作用[11]。在S期阻滞过程中，一些相关的信号通路被激活，从而引发细胞死亡级联反应和增殖抑制[12]。Yang等[13]证实赭曲毒素A通过下调CyclinA2、CDK2的表达，进而诱导人胚胎肾细胞发生S期阻滞。Tu等[14]也发现辛伐他汀通过Chk1-cdc25A-cyclinA/CDK2途径诱导多发性骨髓瘤细胞发生S期阻滞。本研究发现，BAK也可以通过下调CyclinA2和CDK2的表达进而诱导MCF-7细胞发生S期阻滞。
MAPKs是在响应胞外刺激时的一个重要的信号通路，主要包含3个主要家族：ERK、JNK和p38MAPK。研究表明，MAPKs信号通路能够调控细胞周期[15]。在乳腺癌中，p38MAPK作为一个中心激酶在乳腺癌侵袭和转移中也起到至关重要的作用[16]。本研究发现，加入JNK抑制剂SP及p38MAPK抑制剂SB时，BAK对MCF-7细胞的增殖抑制作用减弱，而加入ERK抑制剂PD时，BAK对MCF-7细胞的增殖抑制作用无任何影响，说明BAK是通过JNK和p38MAPK途径诱导MCF-7细胞发生增殖抑制（图9）。
ROS主要以超氧离子（O）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（?OH）等形式存在，在应对各种的胞内和胞外刺激时，ROS被认为是重要的可以决定细胞命运的分子之一[17]。大量研究表明，细胞内ROS过量生成可造成细胞增殖抑制。在本研究中，BAK可诱导MCF-7细胞产生ROS，并引起S期阻滞，当加入ROS清除剂Tiron后，ROS生成量降低，且S期阻滞现象被逆转。当加入p38MAPK抑制剂SB后，ROS生成量降低，且Westernblotting分析也显示加入ROS清除剂Tiron后，不能逆转p38MAPK的表达，以上结果表明，p38MAPK在ROS的上游，即BAK先激活p38MAPK，进而引起ROS的生成，从而使MCF-7细胞阻滞于S期。本研究中，JNK可以诱导MCF-7发生增殖抑制，但当加入JNK抑制剂SP后，ROS生成量没有逆转，说明JNK没有通过ROS的产生发挥增殖抑制作用，具体机制有待进一步研究。细胞增殖是细胞生命活动的基本特征之一，也是生物有机体的重要特点。在胚胎发育的早期细胞以惊人的速度进行分裂，细胞分裂后紧接着进行DNA复制[18]。在细胞周期分裂增殖的过程中，周期蛋白Cyclin和周期蛋白依赖性激酶CDK起着重要的调控作用[19]。CyclinA2/CDK2复合物在S期调控特别是在DNA合成过程中起到非常重要的作用[12]。p53是一种转录因子，在细胞对外界的应激反应中充当重要角色。p53基因是一种抑癌基因，可通过调节一些基因的表达引起细胞周期阻断和细胞凋亡，明显抑制肿瘤细胞的生长，p53可以调控p21的表达，p21能够与CyclinA2/CDK2结合从而抑制其活性[20]。本研究中，Westernblotting结果显示，BAK可时间依赖性地上调p-p53、p21蛋白的表达水平，下调CyclinA2和CDK2蛋白的表达水平。加入活性氧清除剂Tiron之后，其蛋白的表达水平都得到逆转，而G0/G1期和G2/M期的相关蛋白表达并没有随着BAK作用时间的增加而改变。可见，BAK是通过诱导ROS的产生，进而激活p53，然后增加p21的表达，又下调CyclinA2、CDK2蛋白的表达，降低CyclinA2/CDK2复合物的表达，最终造成MCF-7细胞发生S期阻滞。
综上所述，BAK可以明显抑制MCF-7细胞增殖。其可通过p38-ROS-p53途径诱导MCF-7细胞发生S期阻滞，此外，BAK通过JNK但不通过ROS途径抑制细胞增殖。本研究为BAK抗乳腺癌的深入研究及临床应用提供理论依据。
参考文献（略）来源：张哲楠，邱琬婷，曹世杰.补骨脂酚诱导人乳腺癌MCF-7细胞S期周期阻滞及机制研究[J].中草药,,51(3):-.预览时标签不可点
